第110回
問118
理論問題｜生物
サンドイッチELISA法によるサイトカイン定量
問118（理論）
マクロファージをリポ多糖で刺激して得た培養液を採取し、この培養液中のサイトカインXの濃度をサンドイッチELISA（Enzyme-linked immunosorbent assay）法で定量することにした。各試料をマイクロプレートに採取し反応を行った後、450 nmの吸光度を測定した。サイトカインXの標準物質を用いて標準曲線（検量線）を作成したところ、下図のようになった。この測定に関する記述として適切なのはどれか。2つ選べ。
標準曲線（検量線）：サイトカインX濃度 vs 吸光度（450 nm）
1
この培養液の測定値が吸光度1.5であった場合、培養液を希釈して再測定することが必要である。
—
2
10倍希釈した培養液の測定値が吸光度0.6である場合、もとの培養液中のサイトカインX濃度は約600 pg/mLである。
—
3
培養液に含まれる別のサイトカインYを測定するためには、サイトカインXの測定とすべて同じ抗体を利用できる。
—
4
サンドイッチELISA法では抗原に対する2種類の抗体が使われるが、それぞれの抗体が認識するエピトープは異なる。
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5
この培養液の測定で発色が検出限界以下だった場合、標準曲線（検量線）の測定の場合よりも反応時間を長めにしてもよい。
—
正解です！
解説でサンドイッチELISA法の原理と検量線の使い方を確認しましょう。
不正解です。正解は 1、4 です。
解説でサンドイッチELISA法の原理と検量線の使い方を確認しましょう。
解説を見る▼
サンドイッチELISA法は、抗原（測定対象物質）を2種類の抗体で「挟み込む（サンドイッチする）」ことで、特異性・感度を高めた定量法です。マイクロプレートに固相化した「捕捉抗体（1次抗体）」で抗原を捕まえ、酵素標識した「検出抗体（2次抗体）」で発色させ、吸光度から濃度を算出します。
サンドイッチELISA法の原理
・捕捉抗体と検出抗体は、同一の抗原（サイトカインXなど）上の異なるエピトープ（抗原決定基）を認識する必要がある（同じ部位を認識すると、片方の抗体が結合した時点でもう片方が結合できず、サンドイッチが成立しない）
・標準曲線（検量線）は、既知濃度の標準物質を用いて吸光度との関係をプロットしたもので、この直線性のある範囲内でのみ、未知試料の濃度を正確に算出できる
・測定条件（反応時間・温度など）は、標準曲線の作成時と検体の測定時とで厳密に同一に揃える必要がある。条件を変えると吸光度と濃度の対応関係（検量線）がずれてしまい、正確な定量ができなくなる
・捕捉抗体と検出抗体は、同一の抗原（サイトカインXなど）上の異なるエピトープ（抗原決定基）を認識する必要がある（同じ部位を認識すると、片方の抗体が結合した時点でもう片方が結合できず、サンドイッチが成立しない）
・標準曲線（検量線）は、既知濃度の標準物質を用いて吸光度との関係をプロットしたもので、この直線性のある範囲内でのみ、未知試料の濃度を正確に算出できる
・測定条件（反応時間・温度など）は、標準曲線の作成時と検体の測定時とで厳密に同一に揃える必要がある。条件を変えると吸光度と濃度の対応関係（検量線）がずれてしまい、正確な定量ができなくなる
各選択肢の解説
◯ 1 標準曲線は、プロットされている最大濃度（約960 pg/mL、吸光度約0.93）までしか直線性が確認されていない。吸光度1.5は検量線の範囲を大きく超えており、この範囲では吸光度と濃度の対応関係が保証されない（プラトーに達している可能性もある）ため、培養液を希釈して検量線の範囲内に収まるよう再測定する必要がある
× 2 10倍希釈した培養液の吸光度0.6は、検量線から読み取ると希釈後の濃度で約600 pg/mLに相当する。もとの（希釈前の）培養液中の濃度を求めるには希釈倍率（10倍）を掛け戻す必要があり、正しくは約6000 pg/mLである。希釈倍率を掛け忘れている点が誤り
× 3 サイトカインYを測定するには、サイトカインYに特異的に結合する抗体（捕捉抗体・検出抗体）が別途必要である。抗体は抗原特異性が高く、サイトカインX用の抗体をそのままYの測定に流用することはできない
◯ 4 サンドイッチELISA法で使われる2種類の抗体（捕捉抗体・検出抗体）は、同一抗原上の異なるエピトープを認識する必要がある。同じエピトープを認識してしまうと、2つの抗体が抗原上で競合し、サンドイッチ構造を形成できない
× 5 標準曲線の作成時と検体の測定時とで反応時間などの条件が異なると、吸光度と濃度の対応関係が標準曲線からずれてしまい、正確な定量ができなくなる。検出限界以下だからといって検体だけ反応時間を延ばすことは、標準曲線との整合性を崩すため不適切である
◯ 1 標準曲線は、プロットされている最大濃度（約960 pg/mL、吸光度約0.93）までしか直線性が確認されていない。吸光度1.5は検量線の範囲を大きく超えており、この範囲では吸光度と濃度の対応関係が保証されない（プラトーに達している可能性もある）ため、培養液を希釈して検量線の範囲内に収まるよう再測定する必要がある
× 2 10倍希釈した培養液の吸光度0.6は、検量線から読み取ると希釈後の濃度で約600 pg/mLに相当する。もとの（希釈前の）培養液中の濃度を求めるには希釈倍率（10倍）を掛け戻す必要があり、正しくは約6000 pg/mLである。希釈倍率を掛け忘れている点が誤り
× 3 サイトカインYを測定するには、サイトカインYに特異的に結合する抗体（捕捉抗体・検出抗体）が別途必要である。抗体は抗原特異性が高く、サイトカインX用の抗体をそのままYの測定に流用することはできない
◯ 4 サンドイッチELISA法で使われる2種類の抗体（捕捉抗体・検出抗体）は、同一抗原上の異なるエピトープを認識する必要がある。同じエピトープを認識してしまうと、2つの抗体が抗原上で競合し、サンドイッチ構造を形成できない
× 5 標準曲線の作成時と検体の測定時とで反応時間などの条件が異なると、吸光度と濃度の対応関係が標準曲線からずれてしまい、正確な定量ができなくなる。検出限界以下だからといって検体だけ反応時間を延ばすことは、標準曲線との整合性を崩すため不適切である
引っかけポイント：
・選択肢2：検量線から読み取った値は「希釈後の試料中の濃度」であることを忘れず、必ず希釈倍率を掛け戻して元の濃度を算出する。この掛け算を忘れる計算ミスが最も陥りやすい
・選択肢5：「検出限界以下で困っているから条件を工夫してもよい」という現場感覚的な発想に流されず、標準曲線との測定条件の一致が定量精度の大前提であることを踏まえる
・選択肢3：「抗体＝抗原に特異的に結合する」という基本原則を、複数のサイトカインの測定という応用場面でも忘れないようにする
・選択肢2：検量線から読み取った値は「希釈後の試料中の濃度」であることを忘れず、必ず希釈倍率を掛け戻して元の濃度を算出する。この掛け算を忘れる計算ミスが最も陥りやすい
・選択肢5：「検出限界以下で困っているから条件を工夫してもよい」という現場感覚的な発想に流されず、標準曲線との測定条件の一致が定量精度の大前提であることを踏まえる
・選択肢3：「抗体＝抗原に特異的に結合する」という基本原則を、複数のサイトカインの測定という応用場面でも忘れないようにする
臨床メモ▼
薬剤師 あおい
サンドイッチELISA法は、実際の臨床検査でもインフルエンザ抗原検査キットや妊娠検査薬（hCG検出）など、多くの迅速診断キットの原理として使われています。「陽性ラインが出る＝2種類の抗体で抗原を挟み込めた」という仕組みを知っておくと、患者さんへの検査説明にも活かせます。
また、検体の希釈操作を伴う定量検査では、この問題のように「希釈倍率を掛け戻す」計算が実務でも頻出です。臨床検査値を読み解く際は、報告された数値が「希釈後の値」なのか「元の検体の値」なのかを常に意識する習慣をつけておくとよいでしょう。
