第110回
問100
理論問題｜物理
HPLCによる混合物の分析（逆相クロマトグラフィー）
問100（理論）
フェノール、パラオキシ安息香酸及びトルエンを含む混合物試料を高速液体クロマトグラフィー（HPLC）により分析した。このことに関する記述として正しいのはどれか。2つ選べ。なお、HPLCの分析条件は以下のとおりである。
分析条件
検出器：紫外吸光光度計（測定波長：270 nm）
カラム：内径4.6 mm、長さ15 cmのステンレス管に粒径5 μmの液体クロマトグラフィー用オクタデシルシリル化シリカゲルを充てんする。
カラム温度：35℃付近の一定温度
移動相：pH 7.0の0.1 mol/Lリン酸塩緩衝液／メタノール（3：1）混液
検出器：紫外吸光光度計（測定波長：270 nm）
カラム：内径4.6 mm、長さ15 cmのステンレス管に粒径5 μmの液体クロマトグラフィー用オクタデシルシリル化シリカゲルを充てんする。
カラム温度：35℃付近の一定温度
移動相：pH 7.0の0.1 mol/Lリン酸塩緩衝液／メタノール（3：1）混液
1
使用したHPLCは順相クロマトグラフィーである。
—
2
3つの化合物のうち、最後に溶出するのはトルエンである。
—
3
カラム温度を高くするとピーク高さは大きくなり、ピーク面積は減少する。
—
4
パラオキシ安息香酸の保持時間を長くするには、移動相中の緩衝液のpHを低くする。
—
5
トルエンの保持時間を長くするには、移動相中のメタノールの比率を高くする。
—
正解です！
解説で逆相クロマトグラフィーの保持のしくみを確認しましょう。
不正解です。正解は 2・4 です。
解説で逆相クロマトグラフィーの保持のしくみを確認しましょう。
解説を見る▼
本問のカラムにはオクタデシルシリル化シリカゲル（ODS、C18）が充てんされており、これは逆相（ODS）クロマトグラフィー用の固定相です。逆相クロマトグラフィーでは、極性の高い化合物ほど先に溶出し、極性の低い（疎水性の高い）化合物ほど後に溶出します。
逆相クロマトグラフィーの基本と各化合物の性質
・固定相：オクタデシルシリル化シリカゲル（ODS）は疎水性の固定相を持つ逆相用カラム
・溶出順：極性の高い化合物が先、疎水性の高い化合物が後に溶出
・パラオキシ安息香酸：カルボキシ基（pKa≈4.5）を持ち、pH7.0では大部分がイオン化（陰イオン）し極性が高い→最も早く溶出
・フェノール：フェノール性水酸基（pKa≈10）はpH7.0でほぼ非イオン化。中程度の極性
・トルエン：芳香族炭化水素で極性が最も低い（疎水性が高い）→最も遅く溶出
・固定相：オクタデシルシリル化シリカゲル（ODS）は疎水性の固定相を持つ逆相用カラム
・溶出順：極性の高い化合物が先、疎水性の高い化合物が後に溶出
・パラオキシ安息香酸：カルボキシ基（pKa≈4.5）を持ち、pH7.0では大部分がイオン化（陰イオン）し極性が高い→最も早く溶出
・フェノール：フェノール性水酸基（pKa≈10）はpH7.0でほぼ非イオン化。中程度の極性
・トルエン：芳香族炭化水素で極性が最も低い（疎水性が高い）→最も遅く溶出
各選択肢の解説
× 1 「順相クロマトグラフィーである」：ODS（オクタデシルシリル化シリカゲル）は疎水性固定相を用いる逆相クロマトグラフィーであり、順相ではない
◯ 2 「最後に溶出するのはトルエン」：トルエンは3化合物中最も疎水性が高く、逆相条件では最も強く保持され最後に溶出する。正しい
× 3 「温度を高くするとピーク高さは大きくなり、面積は減少する」：カラム温度を上げると保持時間が短縮しピークは鋭くなる（高さは増加しうる）が、ピーク面積は注入量（物質量）に対応する量であり、温度変化で減少するわけではない。誤り
◯ 4 「パラオキシ安息香酸の保持時間を長くするには、pHを低くする」：pHを下げるとカルボキシ基の解離が抑制され、分子が中性形（非イオン形）に近づき疎水性が増す（ODSへの保持が強まる）ため、保持時間が長くなる。正しい
× 5 「トルエンの保持時間を長くするには、メタノールの比率を高くする」：逆相条件では、有機溶媒（メタノール）の比率を上げると溶出力が強まり、保持時間はむしろ短くなる。誤り
× 1 「順相クロマトグラフィーである」：ODS（オクタデシルシリル化シリカゲル）は疎水性固定相を用いる逆相クロマトグラフィーであり、順相ではない
◯ 2 「最後に溶出するのはトルエン」：トルエンは3化合物中最も疎水性が高く、逆相条件では最も強く保持され最後に溶出する。正しい
× 3 「温度を高くするとピーク高さは大きくなり、面積は減少する」：カラム温度を上げると保持時間が短縮しピークは鋭くなる（高さは増加しうる）が、ピーク面積は注入量（物質量）に対応する量であり、温度変化で減少するわけではない。誤り
◯ 4 「パラオキシ安息香酸の保持時間を長くするには、pHを低くする」：pHを下げるとカルボキシ基の解離が抑制され、分子が中性形（非イオン形）に近づき疎水性が増す（ODSへの保持が強まる）ため、保持時間が長くなる。正しい
× 5 「トルエンの保持時間を長くするには、メタノールの比率を高くする」：逆相条件では、有機溶媒（メタノール）の比率を上げると溶出力が強まり、保持時間はむしろ短くなる。誤り
| 化合物 | pH7.0での状態・極性・溶出順 |
| パラオキシ安息香酸 | カルボキシ基イオン化・極性高・最も早く溶出 |
| フェノール | 非イオン化・中程度の極性・2番目に溶出 |
| トルエン | 疎水性が最も高い・最後に溶出 ★ |
引っかけポイント：
・選択肢1：「順相」「逆相」の判別は、固定相が親水性（順相）か疎水性（逆相・ODS等）かで決まる。ODSは疎水性固定相であり必ず逆相に分類される
・選択肢3：温度変化でピーク形状（高さ・幅）は変わりうるが、ピーク面積は基本的に物質量（注入量）で決まり、温度による分離条件の変化では大きく変動しないという原則を理解しておくこと
・選択肢4：「pHを下げる＝酸性側にする」ことで、酸性官能基（カルボキシ基）を持つ化合物が中性化して疎水性が増す＝保持が強まるという、逆相HPLCでの酸・塩基化合物の挙動の基本原則を押さえること
・選択肢5：「濃度を高くする＝分離力が強まる」と直感的に誤解しやすいが、逆相HPLCでは有機溶媒比率を上げるほど溶出力が強まり、保持時間は短くなる（メタノール比率と保持時間は逆相関）点を正確に理解すること
・選択肢1：「順相」「逆相」の判別は、固定相が親水性（順相）か疎水性（逆相・ODS等）かで決まる。ODSは疎水性固定相であり必ず逆相に分類される
・選択肢3：温度変化でピーク形状（高さ・幅）は変わりうるが、ピーク面積は基本的に物質量（注入量）で決まり、温度による分離条件の変化では大きく変動しないという原則を理解しておくこと
・選択肢4：「pHを下げる＝酸性側にする」ことで、酸性官能基（カルボキシ基）を持つ化合物が中性化して疎水性が増す＝保持が強まるという、逆相HPLCでの酸・塩基化合物の挙動の基本原則を押さえること
・選択肢5：「濃度を高くする＝分離力が強まる」と直感的に誤解しやすいが、逆相HPLCでは有機溶媒比率を上げるほど溶出力が強まり、保持時間は短くなる（メタノール比率と保持時間は逆相関）点を正確に理解すること
臨床メモ▼
薬剤師 あおい
逆相HPLC（ODSカラム）は、医薬品の含量均一性試験や有効成分・不純物の分析で最も広く使われる分析法の一つです。パラオキシ安息香酸エステル（パラベン類）は化粧品・医薬品の防腐剤として頻用されており、その定量・純度試験でもまさにこのような逆相HPLCが使われます。
実務でHPLCの結果を見る機会は少ないかもしれませんが、「酸性・塩基性の化合物は移動相のpHで保持挙動が大きく変わる」という考え方は、原薬の分析法バリデーションや品質管理の背景を理解する上で役立ちます。国試では、化合物の構造（官能基の有無・pKa）から極性・疎水性を判断し、溶出順序を推測する力が問われます。
